وبلاگ

تشخیصDNA ، یکی از حوزه های مهم بیولوژی مولکولی و مطالعات زیست فناوری است. تشخیص توالی بازهای خاص در نوکلئیک اسیدهای انسانی، ویروسی و باکتریایی از اهمیت بسزایی در حوزه های متعدد برخوردار است که دارای کاربرد در تشخیص: عوامل بیماری، ارگانیسم­های آلوده کننده غذایی، تحقیقات زیست محیطی و علوم جنایی می­باشد. از زمانیکه پالیکیک، فعالیت الکتروشیمیایی نوکلئیک اسیدها را کشف کرد [1]، زیست حسگرها امیدهای تازه­ای برای ایجاد روش های سریع، ارزان و ساده برای تشخیص نوکلئیک اسیدها فراهم ساخته­اند [2]. تشخیص یا آشکارسازی الکتروشیمیایی گونه­ های زیستی براساس واکنش­های الکتروشیمیایی است که در طول فرایندهای تشخیص زیستی اتفاق می­افتد [3] .به علت اینکه واکنش­های الکتروشیمیایی مستقیماً یک علامت الکترونیکی ایجاد می­ کنند، نیازی به دستگاه­های گرانقیمت تبدیل علامت وجود ندارد. علاوه­ بر این، به علت اینکه کاوشگر می ­تواند براحتی بر روی الکترودها تثبیت شود، تشخیص آن می ­تواند توسط آنالیز الکتروشیمیایی ارزانقیمت انجام شود. همچنین سیستم­های قابل حمل برای آزمایشات کلینیکی و تحقیقات زیست­ محیطی توسعه یافته است [4]. ابزارهای الکتروشیمیایی، بسیار حساس، ساده و سریع بوده و براحتی به کار برده می­شوند و با فناوری­های نانو سازگاری دارند. بنابراین به نظر می­رسد، نامزدهای خوبی برای تشخیص سریع و ارزانقیمت بیماری­های ژنی و تشخیص گونه­ های بیولوژیکی پاتوژنی می­باشند.

یکی از بزرگترین چالش‌ها در قلمرو الکتروشیمی تجزیه­ای، طراحی و ساخت الکترودهایی می‌باشد که در حالت ایده‌آل بتوانند به یک گونه‌ی شیمیایی خاص به صورت کاملاً گزینش‌پذیر و با حساسیت بالا پاسخ دهند. زیست ­حسگرهای الکتروشیمیایی، دسته وسیعی از الکترودهای اصلاح شده می­باشند که امروزه بسیار مورد توجه محققین قرار گرفته­اند [5]. زیست حسگر، ابزاری است که از یک لایه فعال بیولوژیکی به عنوان جزء شناساگر استفاده می­ کند تا عوامل فیزیکی برهم­کنش بیولوژیکی را به علامت قابل اندازه ­گیری تجزیه­ای تبدیل کند [6]. دو عامل در طراحی یک زیست حسگر مناسب نقش ایفا می­ کنند: الف) روش مناسب تثبیت پذیرنده زیستی در سطح مبدل که موجب افزایش طول عمر، حساسیت و پایداری آن می­گردد. ب) انتخاب مبدل مناسب. انواع متداول مبدل­های مورد استفاده در زیست حسگرها، شامل مبدل­های: الکتروشیمیایی  [3]، نوری (نورتابی، جذب و رزونانس پلاسمون سطح ) [9]، حساس به تغییر جرم [10] و حرارت می باشند [11]. زیست حسگرها خصوصیات و مزایای خوبی، نظیر: آسانی استفاده، سرعت تشخیص مناسب، حساسیت بالا و هزینه کمتر نسبت به روش­های طیف سنجی وکروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا را دارا می­باشند که قادرند گونه آزمایشی مورد نظر را در غلظت­های بسیار کم در نمونه‌های بیولوژیکی اندازه ­گیری کنند [14-12]. در حقیقت زیست حسگرها، می­توانند با بهره­ گیری از هوشمندی مواد بیولوژیك، تركیب یا تركیباتی را شناسایی نمایند که با آنها واكنش داده و بدین ترتیب یک پیام شیمیایی، نوری و یا الكتریكی تولید کنند. اساس کار یک زیست حسگر تبدیل پاسخ بیولوژیکی به یک پیام قابل اندازه ­گیری است [15]. بطور کلی هر زیست حسگر شامل، اجزای: گونه آزمایشی مورد نظر، لایه زیستی، مبدل، پردازشگر و نمایشگر است. انواع پذیرنده­های زیستی که در زیست حسگرها مورد استفاده قرار می­گیرند، شامل: آنزیم، آنتی بادی، گیرنده­های سلولی، اسیدهای نوکلئیک DNA یا RNA، میکروارگانیسم یا سلول کامل، بافت و غیره هستند [16].

یک زیست حسگر DNA، وسیله­ای است که عامل تشخیص بیولوژیکی آن، کاوشگر DNA است. کاوشگرهای DNA، الیگونوکلئوتیدهای کوتاه تک رشته­ای (ss-DNA) هستند که معمولاً کاوشگر نامیده می­شوند. دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA)، یک مولکول رمزگذار دستورالعمل­های ژنتیکی است که در تمام موجودات زنده، شناخته شده می­باشد. درشت مولکولDNA ، یک ساختار مارپیچی شبیه نردبان دارد که گروه­های فسفات و قند به طور یک در میان، نرده­های نردبان و باز­های آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین پله­های آن را تشکیل می­ دهند که این بازها، دو به دو با یکدیگر توانایی تشکیل پیوند هیدروژنی قوی را دارند. DNA به خاطر حضورگروه­های فسفات در ساختار آن، دارای بار منفی می­باشد و از این رو خاصیت پلی آنیونی را دارد، به طوری كه بازهای آلی به سمت داخل و گروه فسفات به سمت بیرون یا در سطح خارجی درشت مولکول  DNAقرار می­گیرند. در DNA، هر رشته از نوکلئوبازها تنها با یک نوع رشته دیگر از نوکلئوبازها جفت می­شوند که به آن جفت شدن بازهای مکمل می­گویند. در ساختار دو رشته­ایDNA ، باز آدنین در مقابل تیمین با دو پیوند هیدروژنی و گوانین در مقابل سیتوزین با سه پیوند هیدروژنی قرار دارد. پس یک توالی خاص از DNA قادر است تنها به توالی مکمل خود پیوند شود [17]. در سال­های اخیر، تلاش­ های زیادی برای طراحی زیست حسگرهای الکتروشیمیایی با صحت، حساسیت و انتخاب پذیری تقویت شده، انجام شده است [18]. نانوذرات می­توانند در این زمینه بسیار مفید باشند و در طراحی زیست حسگرهای الکتروشیمیایی که نسبت به سایر زیست حسگرها کارائی بالاتری دارند، به طور عمده ای استفاده ­شوند [19].

نانوذرات به عنوان یکی از مهمترین ساختارها در حوزه فناوری نانو، با توجه به اندازه کوچک آنها، خواص فیزیکی، شیمیایی و الکترونیکی منحصر به فردی را نشان می­ دهند که در تهیه زیست حسگرها، بسیار مورد توجه می­باشند [20]. ویژگی­های یک ماده می ­تواند به طور معنی داری با اندازه ذرات آن تغییر کند. بسیاری از خواص ماده، از جمله: ویژگی­های ساختاری، گرمایی، شیمیایی، مکانیکی، مغناطیسی و

 نوری در اثر کاهش اندازه ذره تغییر می­ کند. در نتیجه، با بهره گرفتن از این مواد در ساخت نانوزیست حسگرها، می­توان خواص جدید و مختلفی ایجاد نمود که از آنها، بتوان برای مطالعه بهتر سیستم­های متفاوت استفاده کرد. از میان نانوزیست حسگرها، نانوزیست حسگرهای الکتروشیمیایی رشد خوبی داشته­ است ]21 [.

نانوزیست فناوری DNA،  فناوری بالقوه­ای است که از تلفیق زیست فناوری و فناوری نانو بوجود آمده است. نانوزیست فناوری DNA، از ساختار و خواص مولکول DNA جهت استفاده در زمینه زیستی، مهندسی و پزشکی بهره می­برد. هدف اساسی نانوزیست فناوری DNA، ساخت مواد با ساختار تکرار شونده، وسایل و ماشین­هایی در ابعاد نانو، توسعه­ این ساختارها به سطوح بزرگتر (ماکروسکوپی) با بهره گرفتن از خواص ساختاری و عملکردی و برهم­کنش­های بین مولکولی DNA است. در این زمینه، یکی از مواردی که بسیار مورد توجه محققین قرار گرفته است، مطالعه و بررسی در مورد ساختار DNA و چگونگی عملکرد آن در شرایط محیطی متفاوت و برهم­کنش­های آن با ترکیبات مختلف بوده است [22]. همانطور که می­دانیم مولکول DNA یک ماده ژنتیکی است که حامل اطلاعات ژنتیکی در تمام موجودات زنده می­باشد. مولکول DNA، دارای توالی خاصی ناشی از چگونگی آرایش بازهای تشکیل­دهنده آن می­باشد که این توالی سبب ایجاد خواص خاصی در هر رشته DNA می­گردد. توالی DNA جهت پردازش اطلاعات مفید بوده و سبب می­گردد که ساختار آن به صورت پایا و محکم درآید. علاوه بر این، DNA دارای خواص منحصر به فردی مانند دارا بودن ساختار هندسی در ابعاد نانو، ذخیره و کد کردن اطلاعات، خودتکثیری، خودتشخیصی ساختار و خودآرایی است [23]. امروزه، محققین تعداد زیادی از نانوزیست حسگر DNA ساخته­اند که از آنها در جهت مطالعه برهم­کنش DNA با سایر ترکیبات از جمله: داروها، پروتئین­ها و ترکیبات شیمیایی مختلفی استفاده شده است ]25،24[.

همچنین نانو مواد ، انتقال الکترون بین زیست مولکول­های تثبیت شده و سطح الکترود را آسان می­ کنند. نانوذرات برای تثبیت مولکول­های زیستی­، کاتالیز واکنش­های الکتروشیمیایی، افزایش سرعت انتقال الکترون بین سطح الکترود و پروتئین، نشان دار کردن مولکول­های زیستی و حتی به عنوان واکنشگر عمل می­ کنند [26]. با توجه به بزرگی سطح مؤثر و بالا بودن سطح انرژی، نانوذرات بیومولکول­ها را بشدت جذب کرده و برای تثبیت مولکول­های زیستی در ساخت زیست حسگر بکار می­روند . انواع زیادی از نانوذرات، مانند: نانوذرات اکسیدی (مثلاً 2SiO) برای ساخت حسگرهای الکتروشیمیایی و زیست حسگرها به کار گرفته شده ­اند [29]. این نانوذرات برای تثبیت مولکول­های زیستی به دلیل سازگاری خوب و آماده سازی آسان، استفاده شده ­اند .

DNA تلومری انسان، از تکرارهای پشت سرهم بازهای تیمین، آدنین، گوانین و سیتوزین، CCCTAA)/(TTAGGG تشکیل شده است [32]. تلومرها دارای ساختار خاصی هستند که موجب استحکام و پایداری مولکول خطی DNA می­شوند و انتهای كرموزوم را از تجزیه شدن، نوآرایی و الحاق انتهایی حفظ می­كنند. در هر تقسیم سلولی به شكل پیوسته، بخشی از طول تلومر كوتاه می­ شود. كوتاه شدن پیوسته تلومر به جدا شدن یک سری از پروتئین­ها از ساختار تلومر و تغییر بیان ژن منجر می­ شود. كوتاه شدن مداوم تلومر به توقف چرخه سلولی و مرگ سلولی می­انجامد [35-33]. تلومراز آنزیمی است كه بدون نیاز به الگو، موجب سنتز تلومر می­ شود. این سلول­ها به كمك آنزیم تلومراز، كوتاه شدن تلومر را كه در پی تقسیم­های متوالی روی می­دهد، جبران می­ کنند [36]. با این حال، آنزیم تلومراز، در حدود 90 درصد از سلول­های سرطانی، سطح بالایی از فعالیت را دارد و همین فعالیت بالا منجر به ایجاد سرطان می­گردد    . چنانچه اتصال تلومرازها به نواحی تلومری توسط برهم­کنش مولکول­های کوچک با نواحی تلومری مهار شود، به شکل مستقیم فعالیت تلومراز کاهش می­یابد.

از طرف دیگر، در رشته­های DNAی غنی از باز سیتوزین C، ساختارهایی می تواند شکل بگیرد که در آن، هر C از طریق پیوند هیدروژنی با سه C دیگر در ارتباط باشد، به شرط آنکه Cی مقابل آن به صورت همی پروتونه باشد، یعنی جفت باز C-C+ شکل بگیرد، به چنین ساختاری، ساختار i-motif می­گویند و در شرایطی تشکیل می­ شود که رشته DNA غنی از باز سیتوزین باشد . ترکیباتی که با توالی­های ذکر شده بر همکنش بدهند، قادر به مهارکردن فعالیت تلومراز می­باشند. پایداری ساختارi-motif  به تکرار توالی دارای سیتوزین، pH اسیدی ملایم، ماهیت و غلظت کاتیون­های موجود در محلول بستگی دارد. پایداری ساختار i-motif پیچ خورده در pH اسیدی ملایم، یک استراتژی خوب برای درمان سرطان است، چون می­
تواند از واکنش تلومراز در سلول سرطانی جلوگیری می­ کند [41].

تاموكسیفن‌ یك‌ داروی‌ ضد سرطان‌ است‌ كه‌ برای‌ درمان‌ سرطان‌ pestan‌ تجویز می‌شود. در مواردی‌ كه‌ سرطان‌ به‌ سایر نقاط‌ بدن‌ پخش‌ شده‌ باشد، نیز استفاده‌ می‌شود. این‌ دارو به‌ ویژه‌ بر روی‌ سرطان­هایی‌ كه‌ با استرژون‌ تحریك‌ می‌شوند، مؤثر می‌باشد. استروژن رشد سلول‌های سرطانی pestan را بالا می‌برد. بعضی از سرطان‌های pestan را در دستة گیرندة مثبت استروژن (حساس به هورمون) طبقه ­بندی می‌كنند، بدین معنا که سلول‌های سرطانی پروتئینی دارند که استروژن به آن وابسته است. رشد این سلول‌های سرطانی به استروژن وابسته است. از آنجا كه تاموکسیفن برخلاف تأثیر استروژن بر این سلول‌ها عمل می‌کند، گاهی به آن ضد استروژن نیز می­گویند. تاموکسیفن فقط در درمان گیرندة مثبت استروژن سرطان pestan مؤثر است. بنابراین، باید پیش از تصمیم‌گیری در مورد گزینه‌های درمانی، وضعیت گیرنده‌های هورمون تومور را جهت درمان سرطان pestan تعیین كرد. تاموکسیفن سیترات (غیر استروئیدی ضد استروژن) مهم­ترین عامل هورمونی در درمان سرطان سینه برای بیش از دو دهه شناخته شده که می ­تواند حدود 50 درصد زنانی که در خطر ابتلا به سرطان سینه هستند را درمان کند. این دارو با اتصال به گیرنده­های سیتوپلاسمی (گیرنده­
های استروژن)، تقسیم سلولی را مهار کرده و در فعالیت استروژن، که هورمونی زنانه است، مداخله می­ کند. استروژن احتمال پیشرفت سرطان را در pestan بالا می­برد. تاموکسیفن سیترات دارویی است که به صورت قرص خوراکی عرضه می­ شود [44-42].

در این کار، سعی می­ شود با طراحی زیست حسگرهایی بر مبنای ساختار i-motif، برهم­کنش این ساختار با داروی ضد سرطان تاموکسیفن سیترات، مورد بررسی قرار گیرد. به دلیل اهمیت داروی تاموکسیفن سیترات در درمان سرطان سینه، چندین روش برای اندازه ­گیری این دارو ارائه شده که شامل الکتروفورز موئینه، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا و طیف سنجی می­باشد [45]، اما روش­های ذکر شده، پیچیده و پر هزینه­اند. روش های الکتروشیمیایی نسبت به روش­های­ دیگر، به دلیل: سادگی، حساسیت مطلوب، قابلیت انطباق با فناوری­های جدید، امکان کوچک­سازی سیستم و هزینه پایین، بسیار مورد توجه قرار گرفته­اند [46].

با بهره گرفتن از طیف ­بینی دورنگ ­نمایی دورانی (CD)، می­توان اطلاعاتی را در مورد ساختار تشکیل شده و حالت قرار گرفتن رشته­های DNA برای تشکیل ساختار i-motif بدست­ آورد. ویژگی ممتاز i-motif با طیف بینی دو رنگ نمایی دورانی تعیین می­ شود. معمولا“ در طیف CD برای ساختار  i-motif یک دماغه مثبت نزدیک 280 نانومتر و یک دماغه منفی در 260 نانومتر مشاهده می­ شود [47].

یک الکترود کار مناسب، نقش عمده­ای در توسعه­ی زیست حسگر الکتروشیمیایی دارد. از میان الکترودهای کار مختلف، الکترودهای خمیر کربن (CPE) معمول­ترند زیرا خمیر کربن به راحتی و با هزینه کم تهیه می­
شود و برای تهیه الکترودهای اصلاح شده با ترکیبات دیگر نیز بسیار مناسب هستند [48].

ازاینرو، در بخش اول این کار، یک زیست حسگر الکتروشیمیایی DNA با بهره گرفتن از الکترود خمیر کربن برهنه و خمیر کربن اصلاح شده با نانوذرات 2SiO  تهیه شد. نانوذرات 2SiO  می ­تواند سبب افزایش رسانایی سطح الکترود خمیرکربن شده و موجب بهبود علامت تجزیه­ای الکترود اصلاح شده گردد. نانوذرات 2SiO،  سبب افزایش حساسیت زیست حسگر DNA شده و دستیابی به حد تشخیص­های پایین­تر نسبت به الکترود خمیر کربن برهنه را فراهم خواهد کرد. به دلیل اهمیت ساختار  i-motif -DNA­در سلول­های بدن انسان و اهمیت زیاد این ساختار در بلوکه کردن انتهای تلومرها و مهار آنزیم تلومراز و همچنین بیماری­های ناشی از سرطانی شدن سلول­ها، مطالعه این نوع ساختارهای DNA و پایدار کردن آنها در اثر ایجاد پیوند با داروی تاموکسیفن به عنوان لیگاند مورد توجه قرار می­گیرد. برای بررسی رفتار تاموکسیفن سیترات در پایدار کردن این ساختار، از فنون مختلف الکتروشیمیایی، نظیر: ولتامتری پالس تفاضلی، ولتامتری چرخه­ای استفاده شده و رفتار الکتروشیمیایی زیست حسگر تهیه شده قبل و بعد از مرحله تثبیت و برهمکنش با داروی مورد نظر بررسی می­گردد. همچنین از روش طیف­ بینی دورنگ نمایی دورانی یا CD برای بدست آوردن اطلاعاتی در مورد نحوه برهمکنش این دارو با ساختار  i-motif-DNA و نحوه شکل­ گیری ساختار مورد نظر استفاده می­گردد. همچنین امکان اندازه ­گیری الکتروشیمیایی داروی تاموکسیفن سیترات در سطح الکترود خمیر کربن اصلاح نشده و اصلاح شده با ذرات 2SiO به کمک ولتامتری پالس تفاضلی و ولتامتری چرخه­ای مورد مطالعه قرار می­گیرد.