وبلاگ

دنیایی که ما در آن زندگی می‌کنیم، از میلیون ها سال نوری در عمق فضا گرفته تا هزاران کیلومتر در اعماق زمین از دشت‌ها و جنگلها و کوهستانها گرفته تا دریاها و اقیانوس‌های بیکران، همه و همه دارای اسرار ناشناخته و رموز کشف نشده ای هستند که در ذهن بشر چراها و چگونه‌هایی را پدید می‌آورد و پاسخ به این سؤالات یک نیاز اساسی برای هر فرد محسوب می‌شود. بشر از همان ابتدا درصدد پاسخ به این نیاز خود برآمده است و گام‌هایی را در زمینه‌های مختلف علم برداشته است. از زمان انسان اولیه تا انسان غرق در زندگی ماشینی قرن بیست و یکم این اکتشافات به طرق مختلف ثبت شده‌اند تا همگان از آنها بهره ببرند. ما نیز با بهره‌گیری از این نتایج و تحقیقات به ثبت رسیده و تلاش خود این تحقیق را گردآوری نموده ایم تا گامی هر چند کوچک در راه بی پایان علم در زمینه میکروارگانیسم‌ها برداشته باشیم. میکروارگانیسم‌ها، قدیمی‌ترین موجودات زنده روی زمین هستند ولی چون اندازه آنها بسیار کوچک است از آخرین موجوداتی هستند که شناخته شده‌اند. این موجودات اهمیت ویژه‌ای برای انسان دارند. بعد از شناخته شدن میکروارگانیسم‌ها پیشرفت قابل‌توجهی درامر بهداشت حاصل گردیده است از جمله تولید آنتی‌بیوتیکها، چرا که دانشمندان با مطالعه میکروارگانیسم‌های مفید و مضر(80% مفید و 20% پاتوژن یا بیماری زا) و با بهره گرفتن از علم میکروبیولوژی که همان علم مطالعه و شناخته میکروارگانیسم‌هاست طول عمر آدمی را افزایش داده‌اند و دیگر از اپیدمی‌های کشنده نظیر آبله، طاعون، سرخک، دیفتری و … همانند گذشته خبری نیست.

 

 

گستردگی‌و تنوع‌ کاربردهای‌ بیوتکنولوژی‌، تعریف‌ و توصیف‌ آنرا کمی‌ مشکل‌ و نیز متنوع ‌ساخته‌ است‌. برخی‌ آنرا مترادف‌ میکروبیولوژی‌ صنعتی‌ و استفاده‌ از میکروارگانیسم‌ها و برخی‌ آنرا معادل‌ مهندسی‌ ژنتیک‌ تعریف‌ می‌کنند. در صنعت نیز آدمی با بهره گرفتن از علم بیوتکنولوژی و نقش ارگانیسم‌ها به عنوان کاتالیست از میکروارگانیسم‌ها استفاده کرده است. در واقع میکروبیولوژی صنعتی، واژه‌ای قدیمی است که در مورد استفاده میکروارگانیسم‌ها در صنعت بیان شده است و امروزه آن را به تکنولوژی میکروبی [1]تغییر داده‌اند.

 

امروزه با مطالعات فراوانی که دانشمندان در عرصه‌های مختلف انجام داد‌ه‎اند، می‌توان بی‌اغراق ادعا کرد که استفاده از میکروارگانیسم‎ها انقلاب عظیمی در همه ابعاد زندگی انسان به وجود آورده‌است. بشر با شناخت میکروارگانیسم‌ها از گذشته تا کنون هم توانسته فعالیت های نامناسب آنها را بر زندگی انسان کنترل کند در واقع از آنها بر علیه خودشان استفاده کند و هم از آنها در زمینه‎های گوناگون بهره ببرد.

 

میکروب‌شناسی صنعتی به بررسی این میکروارگانیسم‌ها پرداخته و سعی در شناسایی انواع جدید و تولید موتانتهای میکروبی با کارایی و میزان محصول بیشتر و هزینه کمتر دارد.

 

میکروب‌شناسی صنعتی امروزه وسیعترین زمینه پژوهشهای میکروب‌شناختی را تشکیل می‌دهد و بیشترین هزینه و امکانات را در زیست‌شناسی به خود اختصاص داده است.

 

ﺑﺮ اﺳﺎس آﻣﺎر‌ﻧﺎﻣﻪ داروﻳﻲ ﻛﻪ ﻫﺮ ﺳﺎﻟﻪ ﺗﻮﺳﻂ وزارت ﺑﻬﺪاﺷﺖ ﺗﻬﻴﻪ ﻣﻲ‌ﮔﺮدد، ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﻣﺼﺮف دارو دراﻳﺮان ﻣﺮﺑﻮط ﺑﻪداروﻫﺎی آﻧﺘﻲ‌ﺑﻴﻮﺗﻴﻚ ﻣﻲ‌ﺑﺎﺷﺪ. اریترومایسین ، یکی از انواع ﭘﺮﻣﺼﺮف آنتی‌بیوتیک‌ها است. در ﺳﺎﻟﻬﺎی اﺧﻴﺮ ﺗﻼﺷﻬﺎی ﺑﺴﻴﺎری در ﺟﻬﺖ ﺧﻮدﻛﻔﺎﻳﻲ و ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺑﺮﻃﺮف ﻛﺮدن واﺑﺴﺘﮕﻲ ﻛﺸﻮر در زﻣﻴﻨﻪ‌ﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺻﻨﻌﺘﻲ اﻧﺠﺎم ﺷﺪه ﻛﻪ در اﻳﻦ ﻣﻴﺎن ﺻﻨﺎﻳﻊ داروﻳﻲ از اﻫﻤﻴﺖ وﻳﮋه ای ﺑﺮﺧﻮردار اﺳﺖ. ﺑﻪ دﻟﻴﻞ رﺷﺪ ﻓﺰاﻳﻨﺪه ﺟﻤﻌﻴﺖ و ﻧﻴﺎز ﻛﺸﻮر ﺑﻪ دارو، ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺳﻬﻮﻟﺖ ﺗﻬﻴﻪ دارو ﺑﺎ ﻫﺰﻳﻨﻪ ﻛﻤﺘﺮ ﺑﺮای ﺑﻴﻤﺎران، پژوهش‌های زیادی صورت گرفته است.

 

علم بیوتکنولوژی در رشته‌های مختلف علمی باعث ایجاد نوآوری و پیشرفت‌های چشم‌گیر شده است. تلاش و کوشش ما بر این بوده است که کاربرد این علم را در فرایندهای تولید آنتی‌بیوتیک مورد بررسی قرار دهیم.

تغییرات مداوم آب وهوا، مسئول القای چندین عامل تنش­زا در گیاهان می­باشد. در بین این عوامل، خشکی به­عنوان مهم­ترین تنش غیرزیستی شناخته می­ شود. برای مقابله با این شرایط گیاه باید قادر به درک، پاسخ­دهی و سازگاری نسبت به این تغییرات محیطی بوده و فعالیت­های فیزیولوژیکی خود را تغییر دهد. صدها ژن در گیاهان در پاسخ به تنش رطوبتی القا می­شوند. شناسایی و بررسی ویژگی­های ژن­های تنظیم کننده­ کلیدی دخیل در تحمل خشکی اهمیت فوق­العاده­ای در بهبود ژنتیکی گیاهان دارد. در این تحقیق از دو رقم حساس و مقاوم به خشکی گیاه کلزا (Brassica napus L.) بنام­های Okapi (حساس به خشکی) و      Zarfam (مقاوم به خشکی) استفاده شد. هدف از این پژوهش مطالعه­ بیان 4 ژن درگیر در مسیر ترارسانی علامت (signal transduction) تحت تنش خشکی در دو رقم اکاپی و زرفام می­باشد. بعد از استخراج RNA و ساخت cDNA، پروفایل بیان 4 ژن شامل Protein kinas (PK) ، Auxine– responsive protein، MAPK3 و MAPK4  در زمان­های 0، 3، 12و 24 ساعت خشکی تحت تیمار مانیتول mM  200 در گیاهچه­های 8 روزه کلزا با تکنیک RT-PCR بررسی شد. آزمایش روی کل گیاهچه (Seedling) انجام گرفت. نتایج نشان داد که ژن­های،  Protein kinas (PK) و MAPK4 در رقم حساس، به­ طور معنی­داری افزایش و در رقم مقاوم، به­ طور معنی­داری کاهش سطح بیان نشان داده است. همچنین میزان بیان ژن­ MAPK3 در هر دو رقم افزایش یافته، ولی میزان بیان ژن Auxine- responsive protein در رقم حساس افزایش و در رقم مقاوم کاهش پیدا کرده است. شناخت دقیق نقش این ژن­ها، اصول استراتژی­ های مهندسی ژنتیک موثری برای بهبود تحمل تنش کلزا به ما ارائه خواهد داد. علاوه بر تاثیر تنش مذکور در سطح مولکولی، پاسخ گیاهان در سطح فیزیولوژیکی نیز مورد بررسی قرار گرفت. تنش خشکی موجب احساس کمبود آب در گیاه و در نتیجه بسته شدن روزنه­ها و افزایش احتمال تولید گونه­ های اکسیژن

 فعال در گیاهان می­گردد. افزایش فعالیت آنزیم­ های APX و GPX و CAT، به­عنوان آنتی اکسیدان آنزیمی، دلالت بر این فرایند درون سلولی دارد. با توجه به نتایج بدست آمده، افزایش ROS  موجب افزایش پراکسیداسیون چربی و در نتیجه افزایش سطح MDA  در گیاه گردید. تجمع محلول­های سازگار نیز از جمله مکانیسم­های دفاعی گیاه در برابر تنش کم آبی بوده که خود را در تجمع کربوهیدرات­ها در گیاه نشان داد. با بررسی مطالب فوق نتیجه ­گیری شد که تنش خشکی اثر زیانباری بر رشد گیاه کلزا داشته و رقم اکاپی دارای حساسیت بالا و رقم زرفام دارای حساسیت پائینی نسبت به تنش خشکی می­باشد.

 

کلمات کلیدی: تنش خشکی، بیان ژن، کلزا،  RT-PCR

 

فصل اول:            

 

 

 کلیات     

 

(Brassica napus L.) 1-1 گیاه شناسی کلزا

 

کلزا(Brassica napus L.)  گیاهی یک­ساله، متعلق به خانواده Brassicacea یا Crucifera  و جنس Brassica  است و با نامهای rape، Oilseed rape، rapa، rappi، rapeseed  شناخته می­ شود. کلزا آلوتتراپلوئید با 19 جفت کروموزوم 38X=4=n2 از تلاقی دو گونه  شلغم روغنی(B.compestris/rapa L.)   و کلم روغنی (B.oleracea)  و دو برابر شدن کروموزم­ها در هیبرید حاصل به وجود آمده است. شکل 1 که به مثلث یو[1] مشهور است روابط ژنومی گونه­ های رزاعی جنس براسیکا را نشان می­دهد (کیمبر، 1378).

 

از نظر گیاه­شناسی کلزا دارای دو تیپ پاییزه و بهاره است. در شرایط مطلوب عملکرد نوع پاییزه 20 تا30 درصد بیشتر از نوع بهاره است (دهشیری، 1379). کلزا یک گیاه سرمادوست و روز بلند بوده و بهترین رشد آن در دمای°C20-15 می­باشد. کلزا گیاهی است علفی با دوره رشد یك­ساله، شاخه­های راست و منشعب و دارای ریشه­ای راست که طول و تعداد ریشه ­های فرعی بسته به نوع واریته متفاوت است. گل آذین آن از نوع خوشه است و اغلب گل­ها به رنگ زرد هستند. گل­ها کامل و دارای چهار کاسبرگ، چهار گلبرگ وچهارپرچم بلند و دو پرچم کوتاه، مادگی دو برچه­ای و میوه خورجین است که هر میوه خورجین دارای 15 تا40 بذر کوچک است بذر­های این گونه به رنگ سیاه هستند و نسبت روغن و پروتئین در بذر آن زیاد و مقدار الیاف در كنجاله كمتر است (کیمبر، 1378).

1-1 پروتئین ALCAM(CD166)

 

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده(ALCAM )مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده

 

ایمنوگلوبولین[1] هاست که دارای یک دومین خارج سلولی با 500 امینو اسید ، یک دومین گذرنده از غشا به طول 22 امینو اسید و هم چنین یک دومین کوتاه سیتوپلاسمی به طول 34 امینو اسید می باشد.(اولریچ وایدله و همکاران[2]،2010؛  مایکل بوون و همکاران[3] ،2010 ؛توماس برورنر و         )و از 163q13.1q13.2همکاران[4]،2012) ژن انسانی این پروتئین بروی کروزوم 3 قرار دارد(

 

200 تشکیل شده است همچنین وزن موکلولی ان 105 کیلو Kb اگزون[5] و اندازه ایی بیش از

 

دالتون می باشد(اولریچ وایدله و همکاران ،2010) این پروتئین شامل پنج دومین خارج سلولی  می باشد .(سالمون اوفوری و جودی کینگ[6]،2008C2[7]و سه نوع V[8] ایمنو گلوبولین دو نوع

 

مابکل بوون واروفوو[9]،1999)

 

گیادو اسوارت[10]،2002))ALCAM شکل1- 1  نمای شماتیک از ساختار پروتئین

 

این پروتئین در تعامل سلول- سلول از نوع هموفیلیک و هتروفیلیک نقش دارد.در نوع هموفیلیک    واکنش می دهد.(اولریچ  CD6) و در تعامل هتروفیلیک با ALCAM-ALCAM با خودش (

 

وایدله و همکاران،2010؛ اریک اندرسون و همکاران[11]،2011؛کاترینا فانالی و همکاران[12] ،2014) این پروتئین هم چنین در مهاجرت

 سلولی  نقش ایفا می کند.(جودی کینگک و همکاران [13]،2004 )

 

به طول110 امینواسیدV2  به طول 93 امینو اسید  و هم چنین V1شامل دو قسمت V ناحیه

 

می باشد هم چنین یک ناحیه کوچک به طول 4 امینو اسید این دو ناحیه را به هم متصل می کند..

 

را برای هر دونوع تعامل هموفیلیک و Vمطالعات تهیه نقشه عملکردی دومین ها حضور دومین

 

هتروفیلیک ضروری دانست.(مایکل بوون و همکاران[14]،1996)

 

چندین روش مبتنی بر  روش های ژنومیک[15] و پروتئومیکس[16] این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان انتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال  شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010 ) انتی ژن ها  مارکر های سطح سلولی اند و می توانند برای شناسایی گروه های سلولی که تشکیل دهنده یک ارگان هستند مورد استفاده قرار گیرند.این مارکرها را می توان جهت پیش بینی پاسخ به درمان ،مرتب سازی سلول های بنیادی سرطان، درمان سرطان و مرتب سازی رده های سلولی مورد استفاده قرار داد.(الوین لیو و همکاران[17]، 2004)

 

این پروتئین نقش مهمی در تهاجم و پیشرفت تومو در سرطان کولورکتال  دارد(جیایی وانگ و همکاران[18]،2011)

 

در بافت توموری انسان(مرته تونه ویجر و همکاران[19]،2010)ALCAM شکل1- 2 رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی

 

درطول شکل گیری ضایعات توده ، سلول های سرطانی باید به یکدیگر متصل شوند بنابراین از مولکول های چسبنده برای اینکه با هم بمانند استفاده می کنند.تومور می تواند از طریق افزایش حجم خود به ساختارهای مجاور به طور مستقیم هجوم برده و یا اینکه می توانند سایت های دور متاستاز شوند.متاستاز هنگامی رخ می دهد سلول ها از تومور اولیه جدا شده و محیط خودشان را ترک کرده ، به رگ های خونی یا لمفاتیک حمله کرده و به مکان های دور مهاجرت کنند.با توجه  در چسبندگی سلول ها می توان نقش مهمی را برای این پروتئین در ایجاد ALCAM به اهمیت

 

متاستاز در سرطان کولورکتال قائل بود(سالمون اوفوری و جودی کینگ[20]،2008)

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

 

گرایش :علوم سلولی و مولکولی

 

عنوان : آنالیز مولکولی ژن  مولد کپسول PRP در نمونه های هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b جدا شده از نمونه های بالینی به منظور انتخاب بهترین سویه واکسینال بومی

 

 

 

دانشگاه آزاد اسلامی

 

واحد علوم دارویی

 

دانشکده علوم و فناوری های نوین، گروه زیست شناسی

 

 

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد((M.Sc))

 

گرایش: علوم سلولی و مولکولی

 

 

 

عنوان:

 

آنالیز مولکولی ژن  مولد کپسول PRP در نمونه های هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b جدا شده از نمونه های بالینی به منظور انتخاب بهترین سویه واکسینال بومی

 

 

 

استاد راهنما:

 

سرکار خانم دکتر ناهید مژگانی

 

 

 

استاد مشاور:

 

جناب آقای دکتر محمدحسین بناءبازی

 

 

 

سال تحصیلی: 93-1392

 

 

 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

 

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

 

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

 

عنوان                    فهرست مطالب                صفحه

 

فصل اول: کلیات

 

خلاصه فارسی.. 1

 

فصل اول: کلیات

 

1-1: تاریخچه. 3

 

1-2: خصوصیات عمومی جنس هموفیلوس: 4

 

1-3: نیازهای غذایی.. 6

 

1-4: دسته بندی و تیپ بندی هموفیلوس آنفلونزا 8

 

1-4-1: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 8

 

1-4-2: سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 9

 

1-4-3: دیگر سیستم های دسته بندی: 9

 

1-5: خصوصیات پاتوژنیک… 9

 

1-5-1: آنتی ژن کپسولی.. 9

 

1-5-2: فاکتورهای ویرولانس و آنتی ژن های دیگر: 11

 

1-5-3: عوامل تشکیل کلنی و ویرولانس…. 12

 

1-6: علائم کلینیکی عفونتهای هوفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 13

 

1-6-1: مننژیت… 15

 

1-7:درمان: 15

 

1-7-1: واکسن های موثر و مقایسه آنها 15

 

1-8: تشخیص: 18

 

1-8-1: روش کشت… 18

 

1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT). 19

 

1-8-3: روش مولکولی.. 19

 

1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 19

 

1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی.. 21

 

1-9-1-1: منطقه I. 22

 

1-9-1-3: منطقه II. 22

 

1-9-1-2: منطقه III. 22

 

1-9-1-4: قطعه IS1016 23

 

1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap. 24

 

1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 25

 

1-9-1-7: ژنوتیپ های Hib.. 27

 

1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 28

 

1-11: Real-time PCR.. 28

 

1-11-1: تعریف و مفهوم : 28

 

1-11-2: مزایای روش Real-time PCR: 29

 

1-11-3: انواع روش های Real-time PCR: 29

 

1-11-4: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR: 32

 

1-11-4-1: Absolute Quantification : 32

 

1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد: 32

 

1-11-4-3: Relative Quantification.. 33

 

1-11-5: کاربرد های Real-time PCR: 34

 

1-12: بیان مساله. 34

 

1-13: ضرورت انجام تحقیق.. 35

 

1-14: اهداف پژوهش…. 36

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

 

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1: محیط های کشت… 43

 

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

 

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

 

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

 

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

 

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

 

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت  BHI+ supplemenمایع.. 44

 

3-2: کشت نمونه ها 45

 

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

 

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

 

3-3-2: روش فریز کردن. 45

 

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

 

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

 

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

 

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

 

3-5-1: استخراج DNA  از باکتری به روش جوشاندن. 47

 

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

 

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

 

3-5-2: پرایمرها 48

 

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

 

3-5-3: برنامه PCR.. 49

 

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

 

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

 

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

 

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

 

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

 

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

 

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

 

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

 

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

 

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

 

3-6: استخراج PRP. 54

 

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

 

3-6-2: تهیه  ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

 

3-6-3: تهیه ml 50  محلول NaCl 0.4 M… 55

 

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

 

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

 

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

 

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

 

3-8:تعیین تعداد کپی cap با بهره گرفتن از Real-time PCR: 57

 

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

 

3-8-2: شرایط واکنش: 57

 

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

 

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

 

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

 

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

 

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با بهره گرفتن از PCR : 62

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

 

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

 

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

 

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

 

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

 

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

 

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

 

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

 

4-3: نتایج سنجش PRP  به روش بیال. 72

 

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

 

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

 

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

 

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

 

5-3: پیشنهادات… 87

 

منابع  …   89

 

خلاصه انگلیسی.. 98

 

فهرست جداول

 

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V   7

 

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

 

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

 

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

 

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

 

 

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

 

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

 

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

 

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

 

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K  و L.. 63

 

جدول 4-1: لیست نمونه ها و  نتایج PCR.. 70

 

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

 

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

 

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

 

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

 

جدول 4-8:  نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

 

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

 

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016  نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

 

فهرست تصاویر

 

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

 

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

 

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

 

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

 

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن   18

 

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

 

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

 

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

 

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

 

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

 

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

 

شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA.. 31

 

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

 

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

 

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV  و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65

 

شکل 4-2: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی.. 66

 

شکل 4-3: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67

 

شکل 4-4: نتایج PCR برای ست پرایمر C  و D.. 69

 

شکل 4-5: مدل های پیشنهادی برای جایگاه capb  در نمونه های انتخاب شده 81

 

شکل4-6: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها 82

 

فهرست نمودارها

 

نمودار 4-1: بیان نسبی capb نسبت به ژن مرجع rpoB…………………………………………………… 76

 

نمودار 4-2: بیان نسبی IS1016 نسبت به ژن مرجع rpoB………………………………………………….. 76

 

نمودار 4-3: تعداد کپی در دو جایگاه capB و IS1016 نسبت به جایگاه rpoB در نمونه ها……… 80

 

خلاصه فارسی

 

هموفیلوس آنفلونزای تیپ‌ب (Hib) از مهمترین عوامل ایجاد مننژیت باکتریال در نوزادان و کودکان می‌باشد. مهمترین عامل بیماری‌زایی این باکتری کپسول پلی‌ساکاریدی از جنس PRP می‌باشد که تولید آن تحت کنترل گروهی از ژنها می‌باشد که در جایگاهی به نام capb قرار دارند. واکسیناسیون علیه این بیماری در بیشتر کشورهای جهان انجام شده ولی ایران هنوز به طرح واکسیناسیون سراسری نپیوسته است، به همین دلیل تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفولانزا یک ضرورت محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه آنالیز مولکولی ژنوم باکتری برای انتخاب یک سویه بومی واکسینال می‌باشد. در این تحقیق ابتدا نمونه‌های مشکوک به روش PCR و با بهره گرفتن از 4 جفت پرایمر اختصاصی شناسایی شد، میزان PRP نمونه‌ها به روش بیال اندازه‌گیری شد، سپس تعداد کپی جایگاه cap در نمونه‌های منتخب به روش Real Time PCR و با بهره گرفتن از 3 جفت پرایمر طراحی شده برای مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپی rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهایت ژنوتیپ نمونه‌های منتخب با بهره گرفتن از دو جفت پرایمر اختصاصی مشخص شد.از میان 30 نمونه 18 مورد Hib ،11 مورد غیر از هموفیلوس آنفلونزا و یک مورد  Hib‾ تشخیص داده شد. از میان 5 نمونه منتخب دو نمونه دارای 3 کپی از جایگاه cap بوده و 3 نمونه دارای دو کپی از این جایگاه تشخیص داده شدند. در مرحله آخر تمام 5 نمونه ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. در این مطالعه برای اولین بار در ایران تعیین تعداد کپی و ساختار ژنوم جایگاه cap در سویه‌های بومی انجام شد.

 

کلمات کلیدی: هموفیلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژیت ، Hib

 

فصل اول

 

کلیات

 

1-1: تاریخچه

 

هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال 1892 به وسیله فایفر جدا گردید و تا اوایل دهه 1930، اکثر دانشمندان آن را عامل مولد آنفلونزای اپیدمیک می دانستند. زیرا عموماً همراه با این بیماری بدست می آمد(8). در سال 1933 مسلم گرید که عامل بیماری آنفلونزا ویروس است و این باکتری یک مهاجم ثانوی در اپیدمیها می باشد(1). البته در پاندمی های اخیری که ویروس آنفلونزا عامل آن بوده، نقش نزدیک از این باکتری با ویروس آنفلونزا دیده نشده است و بدین دلیل مسئله سینرژیسمی بین ویروس و باکتری در بیماری های انسانی ناشناخته به نظر می رسد. بنابر این نام آنفلونزا اهمیت اتیولوژیک ندارد(8). آنفلونزا معمولا منصوب به عنوان ” flu”، یک بیماری ویروسی است که بوسیله التهاب حاد مسیر هوایی ناحیه فوقانی دستگاه تنفسی مشخص می گردد. علائم، اغلب با التهاب شدید غشاء مخاط بینی، سردرد، برونشیت و درد عضلانی عمومی شدید[1] پیشرفت می کند(48).

 

کاملترین مطالعات توسط مارگارت پیتمن بین سالهای 1930 تا 1940 صورت گرفت ، او فیزیولوژی، بیماریزایی، مصونیت، اپیدمیولوژی و خصوصیات این باکتری را به صورت کامل شرح داد(1). نام جنس هموفیلوس از دو ریشه یونانی هم  [2]به معنای خون و فیلوس [3]به معنای دوست داشتن گرفته شده است(20) . بر اساس کتاب باکتریولوژی برِگِی[4]، 10 گونه از هموفیلوسها در ارتباط با انسانها نام گذاری شده اند که یکی از آنها گونه آنفلونزا می باشد. بعلاوه 6 گونه نیز در ارتباط با حیوانات بوده و 3 گونه نیز حالت نامشخص دارند.

گوشت طیور یکی از منابع اصلی تامین کننده نیازهای پروتئین حیوانی در تغذیه­ جوامع انسانی بشمار می­رود و امروزه با پیشرفت­هایی که در این زمینه به وجود آمده، این صنعت روز به روز از اهمیت بیشتری برخوردار شده و توجه مسئولین تغذیه را بخود جلب کرده است تا جهت تولید سریعتر و بیشتر پروتئین، شیوه ­های متنوع و مختلفی را در رابطه با ضریب تبدیل غذایی به گوشت در طیور ارائه دهند(39) در سالهای اخیر سرعت رشد جوجه­های گوشتی به دلیل پیشرفت­های موجود در زمینه تغذیه و ژنتیک افزایش یافته است(149) از جمله اقدامات انجام شده در این زمینه، مصرف آنتی­بیوتیک­ها و افزودنی­ها، جهت ضدعفونی و مکمل در تغذیه طیور می­باشد که علاوه بر اثر پیشگیرانه و درمانی، در دوز پایین در مراحل اولیه دوره رشد، باعث افزایش رشد نیز می­گردد(9).

 

طیور، کارآمدترین راه تبدیل محصولات فرعی و ضایعات کشاورزی به گوشت و تخم‏مرغ برای مصرف انسان می‏باشد. بنابراین پرورش طیور و افزایش تولیدات آنها یکی از مهم‏ترین و عملی‏ترین راه‏های تأمین پروتئین حیوانی در کشور ما است. پرورش طیور صنعتی توسعه یافته می‏باشد، به­ طوری­که قادر است غذای قابل مصرف بیشتر و با هزینه­ کمتر، برای جمعیت کشور فراهم سازد(39).کشور ایران هفتمین کشور تولیدکننده مرغ جهان با تولید 2 میلیون تن مرغ آماده طبخ در سال1392 بوده است(19). استان فارس چهارمین استان تولیدکننده مرغ گوشتی با سهم 5/7 درصدی به­شمار می‏آید و پیش بینی می­ شود به استان دوم کشور در سال 1393 تبدیل شود(5). گوشت مرغ مهم‏ترین منبع تأمین کننده پروتئین حیوانی مردم کشور با مصرف سرانه 25 کیلوگرم در سال، محسوب می­ شود(5). سند امنیت غذایی کشور و چشم‏انداز توسعه صنعت مرغداری کشور، نشان­دهنده افزایش تولید و مصرف این محصول در سال‏های آتی است(34). با پیشرفتهایی که در این زمینه به وجود آمده، این صنعت روز به روز از اهمیت بیشتری برخوردار شده و توجه مسئولین تغذیه را به­خود جلب کرده است تا جهت تولید سریعتر و بیشتر پروتئین، شیوه ­های متنوع و مختلفی را در رابطه با ضریب تبدیل غذایی به گوشت در طیور ارائه دهند(38). در سال­های اخیر سرعت رشد جوجه­های گوشتی به دلیل پیشرفت­های موجود در زمینه تغذیه و ژنتیک افزایش یافته است(149). امروزه از مواد افزودنی خوراکی ضد­میکروبی، بطور گسترده در پرورش حیوانات مزرعه­ای، برای افزایش بهره­وری و فراهم نمودن شرایط اکولوژیکی مناسب سیستم گوارشی به­منظور افزایش سرعت رشد، کاهش ریسک در برابر خطر بیماری­ها، استفاده می­ شود(209). افزایش توجه به توسعه مقاومت آنتی­بیوتیکی در باکتری­ ها و احتمال وجود بقایای آنتی­بیوتیکی در فرآورده ­های طیور و همچنین ایجاد سمیت کبدی ناشی از مصرف آنتی­بیوتیک­ها در دوز بالا، تلاش محققان برای یافتن راه­های دیگری غیر از استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در جیره­ی غذایی طیور را سبب شده است(51).

 

با توجه به مشکلات استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در تغذیه جوجه­های گوشتی، نظر محققان به سمت مواد افزودنی دیگری به عنوان جانشین

 آنتی­بیوتیک­ها در غذای طیور معطوف شد، که این مواد افزودنی باعث سلامتی و بهبود میکرو فلور دستگاه گوارش طیور شوند(102).

 

از این رو محققین، ترکیبات گیاهی مختلفی را به عنوان جایگزین آنتی­بیوتیک­ها در مواد تولیدی حیوانی مورد مطالعه قرار داده­اند؛ که باعث بهبود سیستم ایمنی و عملکرد ارگان­های مهم بدن مانند کبد شده و نهایتاٌ سبب افزایش در عملکرد تولیدی آنها نیز شده است(149). گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها از جمله­ این افزودنی­های طبیعی هستند که می­توان از آنها به عنوان آنتی­بیوتیک­های طبیعی استفاده کرد(11) گیاهان دارویی به عنوان افزودنی­های خوراکی طبیعی؛ اخیراً در جیره غذایی طیور جهت بهبود عملکرد و افزایش پاسخ­های ایمنی پرندگان به جای آنتی بیوتیک­ها مطرح شده است(69و71).

 

تمایل به استفاده از گیاهان دارویی در تغذیه دام و طیور را می­توان به صورت افزایش معنی­دار مقالات علمی چاپ شده از سال 2000 به بعد مشاهده کرد(175). عامل اصلی این رخداد، شروع ممنوعیت استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در اتحادیه اروپا از سال 1999 و قطع کامل آن در سال 2006 بوده است(163). گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها، یکی از جایگزین­های مطرح آنتی­بیوتیک­ها هستند که در سال­های اخیر به خاطر ممنوعیت استفاده از آنتی­بیوتیک­ها، مورد توجه قرار گرفته­اند(188).

 

گیاهان دارویی و فرآورده ­های آنها به دلیل عواملی چون؛ ارزش بالای اقتصادی و کم­هزینه بودن تولید آنها، نداشتن اثرات تخریبی بر محیط زیست، ارگانیک بودن این داروها، کم بودن عوارض جانبی در مقایسه با داروهای شیمیایی، کاهش ایجاد مقاومت نسبی عوامل بیماری­زا، انحصاری بودن درمان برخی بیماری­ها با گیاهان دارویی و وجود تجربیات مختلف بالینی، باعث شده­ است تا این منابع دارویی در سال­های اخیر از ارزش و جایگاه خاصی در پرورش، تولید و درمان دام و طیور برخوردار باشند(30). همچنین استفاده از پرو­بیوتیک، پری­بیوتیک و ترکیبات طبیعی به عنوان جانشین آنتی بیوتیک­ها مد نظر قرار گرفته است؛ که برخلاف آنتی­بیوتیک­ها، این ترکیبات طبیعی، اثرات جانبی بسیار کمی داشته و مطمئن­تر هستند(195).

 

تحقیقات نشان می­دهد که بهبود در وزن و سن ارائه به بازار سویه­های امروزی جوجه­های گوشتی، بیشتر ناشی از افزایش شدت انتخاب برای رشد بالاتر می­باشد(177). به­گزینی ژنتیکی، نقش موثری در بهبود سرعت رشد و افزایش وزن جوجه­های گوشتی ایفا کرده است(114). با افزایش شدت انتخاب، میزان اشتهای جوجه­های گوشتی کنونی، افزایش معنی­داری داشته و نمی­توانند بطور بهینه، مصرف اختیاری را مطابق با انرژی مورد نیاز طیور، تنظیم کنند و زمانی که بطور آزاد به خوراک دسترسی داشته باشند؛ حالت پرخوری، نشان داده و بیش از 2 تا 3 برابر نیاز نگهداری و رشد، غذا مصرف می­ کنند(46). به­این دلیل است که؛ افزایش شدت انتخاب برای رشد بالاتر همراه با تغذیه کامل، بروز مشکلاتی مانند افزایش بافت ذخیره چربی ؛ به سطحی بالاتر از نیاز فیزیولوژیک(139)، افزایش اختلالات سیستم­های قلبی و عروقی، افزایش نرخ متابولیکی، اختلالات اسکلتی، حساسیت بالاتر به بیماری­های متابولیکی مانند سندرم مرگ ناگهانی(210)، آسیت(177)، کاهش ایمنی و مقاومت در برابر بیماری­ها؛ که در نهایت امر، منجر به افزایش مرگ و میر و تلفات می­گردد(104).

 

امروزه با توجه به بالا رفتن میزان تولید و مصرف گوشت مرغ، توجه بیشتری به سلامت محصولات طیور می‏شود. مصرف آنتی‏بیوتیك‏ها باعث ظهور مقاومت آنتی‏بیوتیكی شده و عوارض جبران ناپذیری برجای می‏گذارند. از مهم ترین جانشین‏های آنتی‏بیوتیك‏های محرك رشد در صنعت طیور می توان به گیاهان دارویی اشاره كرد(132). گیاهان دارویی علاوه بر اثرات ضدمیكروبی، اثرات مفیدی؛ از جمله: كاهش لیپیدهای سرمی و بهبود دیگر فاكتورهای خونی از جمله آنزیم­ های کبدی دارند(12).

 

در طی سالیان اخیر و به دلیل محدودیت استفاده از آنتی‏بیوتیک‏ها به عنوان افزودنی غذایی در تغذیه دام و طیور و حتی ممنوعیت مصرف، به کارگیری افزودنی‏هایی مانند فیتوبیوتیک‏ها[1]، پروبیوتیک‏ها[2] و به عنوان ترکیبات جایگزین آنتی‏بیوتیک‏ها، مورد توجه صنعت دامپروری و به ویژه صنعت پرورش طیور قرار گرفته است. نتایج حاصل از انجام برخی مطالعات به عمل آمده در ایران نیز نشان‏دهنده امکان استفاده ازاین افزودنی‏ها در تغذیه طیور به منظور افزایش بازدهی تولید آنها می‏باشد(44). پروبیوتیک‏ها، ترکیبات میکروبی زنده­ای هستند که مستقیماً به جیره دام و طیور اضافه می‏شوند و تاثیر بسیار مطلوبی بر عملکرد و سلامت این حیوانات دارند. در سال‏های اخیر پروبیوتیک‏ها به خاطر عدم ماندگاری در لاشه و تأثیرات مفید بر خصوصیات تولیدی طیور جایگاه ویژه‏ای را به خود اختصاص دادند(89). از مهمترین ترکیب­های جایگزین آنتی بیوتیک­ها، گیاهان دارویی و عصاره­های آنها می­باشد. گیاهان دارویی علاوه بر اثرات ضدمیكروبی، فواید دیگری نیز دارند. این اثرات مفید شامل اثرات كاهش لیپیدهای سرمی و بهبود دیگر فاكتورهای خونی است(2). افزودنی­های خوراکی فیتوژنیک[3] به عنوان مواد مشتق شده از گیاهان تعریف می‏شوند که با بهبود ویژگی­های جیره، افزایش تولید حیوان و بالا بردن کیفیت محصولات حیوانی به جیره افزوده می­شوند(77). شکی وجود ندارد که جیره­های غذایی سرشار از اسیدهای چرب اشباع، برای انسان زیان آور است و موجب تشدید بیماری تصلب شرائین در افراد می‏گردد و این امر در کشورهای پیشرفته که دارای منابع غذایی بسیار متنوع هستند باعث نگرانی‏هایی شده است. بحث حاضر مربوط به ترکیبات فیتوژنیک می­باشد که اخیراً از آن‏ها به عنوان افزودنی­های محرک رشد در تغذیه دام و طیور استفاده شده است. از جمله مزایای استفاده از گیاهان دارویی می­توان به ساده بودن کاربرد و نداشتن اثرات سوء در اکثر آن‏ها بر عملکرد حیوانات و نیز باقی